Protocolo de Isoelectroenfoque

Resolubilizar las proteínas precipitadas en 125 µl de tampón de rehidratación (7M urea, 2M tiourea, 4% w/v CHAPS, IPG tampón 0.5% (v/v), 3mg/ml DTT, 0.002% azul de bromofenol) por agitación constante de 1 hora a temperatura ambiente.

Luego, centrifugar las muestras

a 13000 rpm por 10 minutos para remover el material insoluble.

Cuantificar las proteínas

siguiendo el procedimiento descrito previamente. La muestra debe contener entre 50 a 200 µg de proteína.

Colocar el sobrenadante

obtenido sobre uno de los carriles de focalización.

Tratamiento de las tiras IPG

Retirar la tira IPG (7cm) de congelación a -20 °C y colocarla con pinzas sobre el respectivo carril. Dejar humedecer por 2-3 minutos con la solución de proteína.

Proceso de isoelectroenfoque

Luego, agregar 1-2 ml de aceite mineral para evitar evaporación y finalmente colocarlo en el equipo de isoelectroenfoque (PROTEAN IEF Cell, Bio-Rad).

Lavado de las tiras

Finalizado el protocolo, retirar las tiras de los carriles y lavarlas cuidadosamente con agua destilada para remover el aceite.

Tratamiento de las tiras con DTT

Luego tratar las tiras con DTT para su completa reducción, sumergiéndolas en 2.5 ml de tampón de equilibrio + 10 mg/ml DTT (6M urea, 75 mM Tris-HCL pH 8.8, 29.3% v/v Glicerol, 2% w/v SDS, 0.002% azul de bromofenol).

SDS-PAGE

Preparación del gel de resolución

Para la segunda dimensión proceder con la separación electroforética en geles de poliacrilamida al 15%, siguiendo los pasos establecidos a continuación:

Gel de resolución (15%)

  • 2.3 ml Agua destilada
  • 2.5 ml Tampón Tris-HCL 1,5 M, pH 8.8
  • 0.1 ml SDS 10%
  • 5.0 ml Acrilamida/Bis-acrilamida (30% T, 2.6% C)
  • 4.0 µ TEMED
  • 0.1 ml Persulfato de amonio 10%

Preparar geles de acuerdo al protocolo anterior y dejar polimerizar entre 10 a 15 minutos.

Corrida electroforética

Colocar las tiras de IPG obtenidas anteriormente sobre la superficie superior del gel y sellarla agregando una solución conteniendo agarosa 0.5% y azul de bromofenol 0.002% disueltos en tampón de corrida (Tris-HCL 25mM, pH 8.3, glicina 192 mM, SDS 0.1%). Dejar solidificar durante 5 minutos.

Proceder con la corrida electroforética con tampón de corrida, durante 1 h a 200 V.

Visualización de proteínas

Para la visualización de proteínas se procederá con la tinción de nitrato de plata.

Proceso de tinción

  1. Colocar los geles en una solución de etanol 30%, ácido acético 10% durante 30 minutos.
  2. Lavar los geles 3 veces en etanol 30% durante 15 minutos por cada lavado.
  3. Colocar los geles en una solución de bisulfato de sodio 2.5 mM e incubar durante 2 min.
  4. Lavar los geles 2 veces con agua destilada durante 5 minutos por cada lavado.
  5. Luego, sumergir los geles en una solución de nitrato de plata 0.2% conteniendo formaldehído al 37% durante 30 min.
  6. Lavar los geles con agua destilada durante 1 min.
  7. Colocar los geles en una solución de carbonato de sodio 3% conteniendo formaldehído al 37% y tiosulfato de sodio 2.5 mM hasta la aparición de las bandas proteicas.
  8. Detener la reacción agregando una solución de ácido acético 10%.
  9. Finalmente, realizar la captura de la imagen en un fotodocumentador (ChemiDoc XRS, Bio-Rad) y analizar los spots resueltos.

Estimación del peso molecular

Para la estimación del peso molecular de los spot obtenidos se utilizará una mezcla de proteínas de peso molecular conocido: fosforilasa b (97.4 kDa), albúmina sérica bovina (66.3 kDa), deshidrogenasa glutámica (55.4 kDa), deshidrogenasa láctica (36.5 kDa), anhidrasacarbónica (31 kDa), inhibidos de tripsina (21.5 kDa) y lisozima (14.4 kDa).

Extracción de ADN

Preparación de la solución de buffer de extracción CTAB

Preparar una solución de buffer de extracción CTAB (2% w/v CC. Final, 1.4 M NaCl, 20mM EDTA, 100 mM tris-HCL, 1% PVPP). Se usa aproximadamente 1 ml de buffer de extracción CTAB por cada miligramo de tejido seco.

Proceso de extracción

  1. Pulverizar en un eppendorf de 1.5 ml de 10 a 30 mg de tejido foliar seco.
  2. Adicionar la solución de extracción CTAB precalentada a 60ºC, mezclar vigorosamente e incubar de 10 a 60 minutos a 60ºC.
  3. Agregar un volumen igual de cloroformo: isoamil alcohol 24:1, centrifugar por 10 minutos a 10000 rpm en una microcentrífuga a 4ºC, luego tomar el sobrenadante y colocarlo en un eppendorf nuevo.
  4. Agregar RNAasa 10mg/ml e incubar por 30 minutos a 37ºC.
  5. Agregar inmediatamente un volumen igual de cloroformo: isoamil alcohol 24:1, centrifugar por 10 minutos a 10000 rpm en una microcentrífuga a 4ºC, luego tomar el sobrenadante y colocarlo en un eppendorf nuevo.
  6. Adicionar 0.6 volumen de isopropanol helado y mezclar por inversión.
  7. Centrifugar a 8000 rpm por 10 minutos, eliminar el sobrenadante.
  8. Lavar el precipitado con 1.5 ml de solución de lavado (10mM acetato de amonio 70% etanol).
  9. Centrifugar a 8000 rpm por 10 minutos y luego dejar secar el precipitado a temperatura ambiente.
  10. Resuspender el precipitado en 0.5 ml de TE (10mM tris-HCL, 1MM EDTA) y agregar 1/10 volumen de 3M acetato de sodio. Mesclar bien y agregar 2 volúmenes de etanol absoluto helado.
  11. Centrifugar a 5000 rpm por 10 minutos.
  12. El precipitado es resuspendido nuevamente en 0.5 ml de TE.
  13. Conservar a 4ºC.