1. Conceptos Fundamentales de la Hibridación

La hibridación de ácidos nucleicos consiste en la unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos por la complementariedad de su secuencia de bases nitrogenadas, originando una molécula híbrida bicatenaria.

  • Técnicas de hibridación: Permiten detectar secuencias concretas de ácidos nucleicos o dianas (ADN o ARN) mediante el empleo de sondas marcadas.
  • Secuencia diana: Es la secuencia concreta de bases nitrogenadas que se pretende detectar en la muestra problema.
  • Sonda: Es la cadena de nucleótidos cuya secuencia de bases nitrogenadas es complementaria a la secuencia diana.

Las diferentes técnicas de hibridación se diferencian por: el tipo de ácido nucleico, el tipo de sonda, el tipo de marcaje y el medio o soporte (sólido, líquido o in situ).

2. Desnaturalización y Curva de Fusión del ADN

La desnaturalización es una propiedad del ADN que consiste en la separación de las dos cadenas de una molécula bicatenaria por ruptura de los puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias. Se consigue aumentando la temperatura o el pH.

Curva de fusión del ADN

Si se mide la absorbancia a 260 nm de una solución de ADN bicatenario en función de la temperatura, se obtiene una curva sigmoide con tres zonas:

  • Primera zona: Tramo recto sin pendiente. La absorbancia es constante; todo el ADN está en forma de doble hélice.
  • Segunda zona: Aumento de la absorbancia a medida que aumenta la temperatura. Este fenómeno se conoce como efecto hipercromico.
  • Tercera zona: Recta de pendiente nula; la desnaturalización es del 100%.

La temperatura de fusión (Tm) es aquella a la cual la desnaturalización es del 50%. En moléculas grandes, a mayor porcentaje de pares GC, mayor Tm.

3. Renaturalización y Cinética

La renaturalización es el proceso por el cual las cadenas separadas vuelven a reasociarse al bajar lentamente la temperatura. La velocidad depende de la concentración de las cadenas (choque aleatorio).

  • Fase de nucleación: Fase lenta donde se aparean secuencias cortas.
  • Fase de cierre en cremallera: Fase rápida donde se cierra la doble hélice.

En genomas eucariotas, la curva de renaturalización muestra tres componentes: altamente repetidas (rápido), moderadamente repetidas (intermedio) y secuencias únicas (lento).

4. Factores que Influyen en la Hibridación

  • Fuerza iónica: Los cationes neutralizan la carga negativa de los fosfatos.
  • Agentes desnaturalizantes: Solventes como el dimetilsulfóxido y la formamida desestabilizan los puentes de hidrógeno.
  • Mismatch: El porcentaje de bases no complementarias reduce la estabilidad del híbrido y disminuye la Tm.

5. Tipos de Sondas

  • Sondas de ADN: Las más utilizadas por su versatilidad. Pueden obtenerse por síntesis química, ADN recombinante o PCR.
  • Sondas de ARN (Ribosondas): Siempre monocatenarias, pero muy sensibles a la degradación por ARNasas.
  • PNA (Ácidos nucleicos peptídicos): Poseen un esqueleto de aminoetil-glicina. No tienen carga eléctrica y son extremadamente estables.
  • LNA (Ácidos nucleicos bloqueados): Modificados con un puente de oxígeno entre el carbono 2′ y 4′.

6. Marcaje, Purificación y Detección

El marcaje permite visualizar los resultados mediante isótopos radiactivos, fluorocromos o haptenos (digoxigenina y biotina). La purificación (por cromatografía de exclusión o adsorción) es esencial para eliminar nucleótidos libres y evitar ruido de fondo.

La detección del híbrido se realiza mediante:

  • Autorradiografía: Para marcaje radiactivo.
  • Fluorescencia: Para fluorocromos en hibridación in situ.
  • Métodos inmunohistoquímicos: Para haptenos, usando anticuerpos específicos.