Clonación Molecular: Amplificación de Secuencias de ADN

La clonación molecular es el proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADNg o ADNc basado en la tecnología de ADN recombinante.

Componentes y Vectores

Los vectores son moléculas de ADN capaces de replicarse autónomamente y transportar fragmentos de ADN a una célula. Tipos principales:

  • Plásmidos
  • Bacteriófagos
  • Cósmidos
  • Fagemidos: Compuestos por plásmido y origen de replicación del fago M13.
  • Cromosomas artificiales
  • Vectores lanzadera

Células hospedadoras: Bacterianas (la más utilizada es E. coli cepa K12) y eucariotas.

Fases del Proceso de Clonación

  1. Creación del vector recombinante: Preparación del ADN (digestión con enzimas de restricción), preparación del vector (circular a lineal) e inserción del ADN extraño mediante ligasa.
  2. Introducción del vector en la célula:
    • Transformación bacteriana (bacterias competentes).
    • Transfección (células eucariotas).
    • Transducción (mediada por virus).
    • Electroporación.
  3. Selección e identificación de clones recombinantes: Uso de marcadores genéticos (resistencia a antibióticos, enzimas como LacZ, proteínas fluorescentes y genes letales).

Bibliotecas de ADN

Colección de vectores recombinantes cuyas secuencias provienen de un único organismo (ADN genómico o ADNc a partir de ARNm). Se utilizan para identificación, paseo cromosómico y secuenciación.

Secuenciación de Ácidos Nucleicos

Determinación de la secuencia de nucleótidos de una molécula.

Métodos de Terminación de Cadena (Sanger)

Utiliza fragmentos cortos de ADN monocatenario. Incluye la reacción de polimerización, electroforesis en poliacrilamida y autorradiografía.

Generaciones de Secuenciación

  • 1ª Generación: Método enzimático con fluoróforos y secuenciadores automáticos. Incluye PCR convencional y de secuenciación.
  • 2ª Generación (NGS): Tecnologías para genomas completos de bajo coste (ej. pirosecuenciación, PCR en emulsión o puente).
  • 3ª Generación: Uso de detectores ópticos como nanoporos o sensores de pH (Ion Torrent).

Aplicaciones: Secuenciación de genoma completo, diagnóstico de enfermedades hereditarias, cáncer y medicina forense.

Genética Forense y Bioinformática

Análisis de la variabilidad genética para la identificación humana.

Organización del ADN y Polimorfismos

  • ADN repetido en tándem: Satélite, minisatélite (VNTR) y microsatélite (STR).
  • Polimorfismos: Variaciones en la secuencia (longitud o secuencia, como los SNP).

Técnicas de Identificación

  1. RFLP: Digestión de VNTR, electroforesis e hibridación.
  2. STR mediante PCR: Amplificación de marcadores (15 STR autosómicos + amelogenina).
  3. Análisis de SNP, ADNm y cromosoma Y.

Bioinformática

Uso de herramientas como bases de datos de secuencias y algoritmos de alineamiento (BLAST) para el análisis de datos genéticos.