Técnicas de Precipitación

1. Fundamento

Las técnicas de precipitación se basan en la reacción entre antígenos (Ag) solubles y anticuerpos (Ac) solubles. Cuando estos reaccionan en proporciones adecuadas, forman inmunocomplejos insolubles que precipitan, ya sea espontáneamente o mediante centrifugación.

Para que la reacción de precipitación ocurra, los antígenos deben:

  • Ser solubles y estar libres.
  • Poseer dos o más epítopos (determinantes antigénicos).
  • Estar en proporciones equivalentes con los anticuerpos.

2. Características de la Reacción de Precipitación

  • Poco sensible: No detecta concentraciones inferiores a 0,1 mg/dl.
  • Especificidad: Todas las inmunoglobulinas (Ig) son precipitantes, siendo las IgG las más eficaces.
  • Son altamente específicas.
  • Pueden cuantificarse de manera precisa.

La ausencia de precipitación no necesariamente indica la ausencia de anticuerpos en el suero frente al antígeno ensayado, ya que podrían encontrarse en cantidad insuficiente o no ser precipitantes. Por ello, las técnicas de precipitación tienen una utilidad limitada en el diagnóstico serológico de enfermedades infecciosas.

2.1. Proporciones Relativas de Ag y Ac

Existen fenómenos que afectan la formación del precipitado:

  • Fenómeno de prozona: Al inicio de la adición del antígeno, existe un exceso de anticuerpos. La mayoría de los anticuerpos se unen a los antígenos por un solo brazo, formando complejos solubles y no contribuyendo a un precipitado visible.
  • Fenómeno de postzona: En caso de exceso de antígeno, la concentración de anticuerpos no es suficiente para formar un precipitado visible. El precipitado generado en la zona de equivalencia puede redisolverse por completo, formando complejos pequeños que no precipitan.
  • Zona de equivalencia: Es la zona donde la proporción de antígeno y anticuerpo es adecuada para la formación de inmunocomplejos insolubles, alcanzando el punto máximo u óptimo de precipitación.

3. Factores que Afectan las Reacciones de Precipitación

  • Proporción Ag-Ac: Debe ser la adecuada para la formación del precipitado.
  • Temperatura: Mayor reactividad a 37°C.
  • pH: Óptimo entre 6 y 7,5.
  • Concentración iónica del medio: Si es mayor de 0,15 M, disminuye la cantidad de precipitado.
  • Características del Ac: La afinidad (fuerza de unión de una molécula con otra a través de un solo sitio de unión) y la avidez (fuerza global de unión resultante cuando intervienen varios sitios de unión) son cruciales.

4. Tipos de Reacciones de Precipitación

4.1. Según la dirección de la difusión:

  • Unidimensional: Realizada en un tubo.
  • Bidimensional: Realizada en una superficie (portaobjetos o placa de Petri).

4.2. Según la difusión de los reactivos:

  • Doble: Difunden tanto el antígeno como el anticuerpo.
  • Simple: Solo difunde un reactivo, el otro está incorporado al medio.

5. Inmunodifusión Simple Bidimensional (Inmunodifusión Radial Simple en Placa o Test de Mancini)

Fundamento: Es una reacción de precipitación en medio sólido (gel de agar) sin aplicación de corriente eléctrica. Es una técnica cuantitativa donde se pone de manifiesto la difusión de un antígeno en un gel que contiene anticuerpos. Se producen anillos de precipitado directamente proporcionales a la concentración del antígeno.

En esta técnica, el anticuerpo o el antígeno está incorporado en un gel de agar sobre una placa de Petri. La capa de gel contiene pocillos donde se deposita la muestra, la cual difundirá en círculo. Cuando el antígeno o anticuerpo alcanza la zona de equivalencia, se produce la precipitación en forma de anillo (halo). El diámetro del halo es directamente proporcional a la concentración del antígeno en la muestra. Se emplea para la cuantificación de inmunoglobulinas, proteínas plasmáticas (transferrina, antitrombina) y algunos antígenos.

Inmunoanálisis Enzimático (ELISA)

1. Fundamento

Las técnicas ELISA se basan en la identificación de los complejos antígeno-anticuerpo mediante el empleo de enzimas (peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa). Estas enzimas, al actuar sobre un sustrato, producen reacciones coloreadas que pueden medirse por espectrofotometría.

La cuantificación de la formación del inmunocomplejo se realiza midiendo la actividad enzimática del marcador. Se mide la absorbancia del color obtenido al añadir un sustrato cromogénico, que en presencia de la enzima se transforma en un producto coloreado. La absorbancia se extrapola en una curva de calibración.

Características de las Enzimas Marcadoras

  • Bajo coste y fácil obtención.
  • Alto nivel de pureza.
  • No estar presentes de manera significativa en el organismo.
  • Actividad específica y estable.
  • Medida sensible, sencilla y rápida.

2. Utilidades

  • Hormonas.
  • Antígenos de hepatitis.
  • IgE para diversos antígenos.
  • Detección de infecciones: rubéola, hepatitis, SIDA, rotavirus, varicela, herpes.

Determinación de Resultados

  • Cualitativa: Ausencia o presencia de color.
  • Semicuantitativa: Escala de colores.
  • Cuantitativa: Espectrofotometría.

3. Ventajas

  • Gran sensibilidad.
  • Equipamiento sencillo.
  • Bajo riesgo.
  • Detecta antígenos directamente en los tejidos.

4. Tipos de ELISA

Según la conducta de la enzima actuando como marcador, los métodos ELISA se dividen en:

4.1. Homogéneos

En estos métodos, la enzima está activa o inactiva dependiendo de si se forma o no el complejo antígeno marcado-anticuerpo. Por lo tanto, no es necesario un paso intermedio de lavado.

  • Características: Sencillos, menos sensibles que los heterogéneos. Se utilizan para determinar hormonas (tiroxina), drogas de abuso y medicamentos (digoxina).
  • EMIT (Enzimoinmunoanálisis Multiplicado): Es el método homogéneo más utilizado. Se basa en la competencia entre el antígeno y el antígeno marcado por el anticuerpo. Cuando el antígeno marcado se une al anticuerpo, la actividad enzimática es inhibida.

Reactivos en EMIT: Hapteno + enzima (Ag marcado), anticuerpo antihapteno (Ac específico), sustrato de la enzima.

Muestra: Suero o plasma que contiene el hapteno (Ag) a estudiar.

Resultado: A mayor concentración de hapteno en la muestra, menor cantidad de Ac-H quedará libre para unirse con el Ag marcado. Por lo tanto, mayor será la cantidad de Ag marcado libre (con la enzima activa) que producirá producto coloreado. Existe una relación directamente proporcional entre la concentración de hapteno en la muestra y la presencia de producto coloreado.

Excepción (Tiroxina): En la determinación de tiroxina, al unirse el anticuerpo marcado, se produce la activación de la enzima, no la inactivación. En este caso, la relación entre la cantidad de enzima activa y el producto coloreado es inversamente proporcional a la concentración de tiroxina.

  • Inconvenientes: Limitado a drogas o medicamentos para los cuales se puedan obtener anticuerpos específicos. Solo se puede analizar una droga o medicamento por análisis.
  • Ventajas: Material y técnica sencillos, gran estabilidad de los reactivos, técnicas rápidas, alta especificidad y sensibilidad, poco volumen de muestra.

4.2. Heterogéneos

En estos métodos, la enzima tiene actividad enzimática independientemente de si está unida o no al complejo antígeno-anticuerpo. Por lo tanto, antes de añadir el sustrato, se requiere un paso de lavado o separación de la enzima libre de la enzima que forma parte del inmunocomplejo.

Los métodos de separación incluyen la técnica del doble anticuerpo o el uso de soportes sólidos (técnicas ELISA). Las técnicas ELISA utilizan soportes sólidos a los que se une el antígeno o el anticuerpo.

Tipos de ELISA Heterogéneo:
  • Enzimoinmunoensayo competitivo para la determinación de Ag: El antígeno de la muestra y el marcado con la enzima compiten por el anticuerpo. A mayor cantidad de Ag en la muestra, menor cantidad de Ag marcado quedará libre y será eliminado por el lavado, resultando en menor actividad enzimática. La coloración obtenida es inversamente proporcional a la cantidad de Ag en la muestra.
  • Determinación de Ag usando Ac marcados (ELISA enzimométrico): A mayor cantidad de Ag en la muestra, menos anticuerpos marcados se unirán a la fase sólida, produciendo menos color. La coloración obtenida es inversamente proporcional a la cantidad de Ag en la muestra.
  • Método sándwich para determinación de Ag: El antígeno debe poseer dos lugares de unión. Se utiliza un primer anticuerpo (Ac1) unido a la fase sólida y un segundo anticuerpo (Ac2) marcado con enzima. El color obtenido es directamente proporcional a la concentración de Ag en la muestra.
  • ELISA para la determinación de Ac (ELISA indirecto): El anticuerpo de la muestra se enfrenta al antígeno unido a la fase sólida. Se lava y se agrega un anticuerpo antiglobulina humana marcado con enzima. La coloración obtenida es directamente proporcional a la concentración de Ac en la muestra.
  • Captura: Variante del indirecto. Se utiliza un anticuerpo antiglobulina humana unido a la fase sólida. Detecta anticuerpos mediante la utilización de un anticuerpo antiinmunoglobulina humana fijado a la fase sólida. La intensidad del color producido es directamente proporcional a la concentración de Ac en la muestra.

Aplicaciones del Enzimoinmunoensayo Heterogéneo

Estas técnicas son muy útiles por su alta sensibilidad, especificidad, sencillez y estabilidad de los reactivos. Permiten detectar antígenos y anticuerpos en cualquier fluido biológico.

Se utilizan para detectar:

  • Anticuerpos contra agentes causantes de enfermedades:
    • Bacterianas: sífilis, brucelosis.
    • Parasitarias: toxoplasmosis, malaria.
    • Virales: herpes, hepatitis B.
    • Micosis: candidiasis.
  • Hormonas: tiroxina, progesterona.
  • Inmunoglobulinas.
  • Marcadores tumorales.

Pruebas Diagnósticas para Determinación de Embarazo

A. Biológicas (Históricas)

  • Reacción de Ascheim-Zondek (AZ): Inyección de orina de mujer embarazada a una rata hembra, provocando madurez sexual y aumento del tamaño uterino debido a la acción de la HCG.
  • Reacción de Galli-Manini: Inyección de orina de mujer embarazada a una rana macho; la HCG provoca espermatogénesis y eyaculación.
  • Reacción de Kupperman: La HCG provoca la aparición de cuerpos hemorrágicos en los ovarios de las ranas.
  • Reacción de Friedman: Inyección de orina de mujer embarazada a una coneja, produciendo ovulación.

B. Inmunológicas

Se basan en la detección de la hormona gonadotropina coriónica humana (HCG), secretada desde la implantación del embrión y presente en suero y orina poco después de la concepción. Su concentración aumenta rápidamente.

  • Inhibición de la Aglutinación: La orina se pone en contacto con anti-HCG, y posteriormente se añaden hematíes de carnero sensibilizados con HCG o partículas de látex sensibilizadas con HCG.
  • Inmunocromatografía Coloreada: Pruebas rápidas (3 minutos) y específicas que detectan la subunidad beta de la HCG, evitando falsos positivos por la presencia de LH. Se comercializan en tiras o dispositivos.

Funcionamiento de la Inmunocromatografía:

  1. Una almohadilla contiene anticuerpos anti-HCG conjugados con oro coloidal.
  2. Una membrana de nitrocelulosa contiene:
  • Línea de Test (T): Recubierta con anticuerpos anti-HCG contra otro epítopo del antígeno.
  • Línea de Control (C): Recubierta con anticuerpos control (anti-conjugado) que se unen a la combinación de anticuerpo anti-HCG-oro coloidal, formando una línea oscura incluso sin HCG.

Fundamento: Al aplicar la muestra, migra a lo largo de la membrana. Si la orina contiene HCG, el anticuerpo conjugado con oro captura la HCG formando un complejo Ag-Ac. Este complejo se une a los anticuerpos en la línea T, produciendo una línea de color rosa. La banda de color rosa en la línea T confirma la presencia de HCG y la correcta realización de la prueba.