Cromatografía de Capa Fina (TLC): Fundamentos y Aplicaciones

La Cromatografía de Capa Fina (TLC) es una técnica separativa que se emplea comúnmente para la separación de principios activos en preparados farmacéuticos analgésicos. Consiste en comparar nuestra muestra con parámetros de una muestra pura.

Componentes de la Cromatografía

  • Fase estacionaria o fija: una fina capa de material adsorbente depositada sobre una superficie plana.
  • Fase móvil o eluyente: su elección es crucial para una buena separación.

Mecanismos de Retención en Cromatografía Líquida

En cromatografía líquida, si la fase estacionaria es:

  • Sólida: los compuestos se retienen por adsorción.
  • Líquida: el mecanismo es el reparto (partición).

La retención y la selectividad en la separación dependen de la polaridad del compuesto (la polaridad de la fase móvil debe ser similar a la de los compuestos) y de la naturaleza del disolvente que compone la fase móvil.

Mecanismo y Parámetros Cromatográficos

Mecanismo de Separación

El compuesto se introduce en la fase móvil. Los compuestos polares se adhieren más a la fase estacionaria que los no polares. Se aplica un disolvente (fase móvil) que, si es afín al compuesto, lo disolverá y arrastrará. Cuanto mayor sea la afinidad, mayor será su desplazamiento; si la afinidad es baja, el desplazamiento será menor.

El componente se desplazará hacia la fase móvil o estacionaria según su mayor afinidad por una u otra. La muestra se mueve con el eluyente a lo largo de la placa. Las moléculas se distribuyen entre la fase móvil y la fase estacionaria.

Parámetros Cromatográficos Clave

Constante de Distribución (K)

La constante de distribución (K) es la relación entre las concentraciones de una sustancia entre dos fases e indica cómo se reparte un soluto (A) entre la fase estacionaria (FE) y la fase móvil (FM).

Factor de Retención (Rf)

El factor de retención (Rf) hace referencia a la cantidad total de soluto en cada fase. Se calcula como la distancia recorrida por la sustancia dividida por la distancia recorrida por el frente del eluyente (fase móvil). Este factor indica el grado de movimiento de la sustancia y es característico de cada una.

Factor de Separación o Selectividad (α)

El factor de separación o selectividad (α) relaciona la distribución de dos solutos (A y B) de una mezcla. Permite determinar la eficiencia de separación entre dos componentes. Siendo B la especie que más avanza y A la especie que menos avanza. Si este valor es 1, no es posible la separación, ya que ambos se moverían de la misma manera.

Resolución (Rs)

La resolución (Rs) es una medida cuantitativa de la capacidad de un sistema cromatográfico para separar dos sustancias.

Consideraciones Prácticas en TLC

Es necesario dejar evaporar el cloroformo para que no interfiera con la fase móvil. Se utilizan lámparas UV para visualizar las manchas, ya que los compuestos absorben la luz ultravioleta, son capaces de emitir fluorescencia y, en algunos casos, se colorean de rojo.

Espectrofotometría Ultravioleta-Visible (UV-Vis): Cuantificación de Sustancias

La espectrofotometría ultravioleta-visible (UV-Vis) es una técnica utilizada en la cuantificación de sustancias farmacéuticas, siendo posible su uso para la determinación de la concentración de vitaminas, tanto puras como en mezclas.

Conceptos Fundamentales en Espectrofotometría

Transmitancia (T)

La transmitancia (T) es el cociente entre la intensidad de la radiación a la salida y la intensidad incidente. Ofrece información sobre la proporción de radiación transmitida.

Absorbancia (A)

La absorbancia (A) indica la cantidad de radiación absorbida.

Consideraciones en la Medición de Vitaminas (B12 y B2)

¿Por qué no se mide el máximo en la vitamina B12?

No se mide el máximo en la vitamina B12 porque existe una longitud de onda con un pico de absorción intenso donde se observan diferencias significativas, y la vitamina B2 no absorbe a esa longitud de onda (ej. 550 nm). Esto simplifica el sistema de ecuaciones, ya que el factor de la B2 en esa longitud de onda sería cero.

¿Por qué en el caso de la vitamina B2 se mide en el máximo?

Se mide en el máximo de absorción porque se minimiza el error en la determinación de la concentración. Al calibrar en el punto de mayor intensidad de absorción, las diferencias de concentración se aprecian mejor y la medición está sujeta a menor error.

Fluorescencia y Quenching: Principios y Aplicaciones

La Lucigenina como Fluoróforo

La lucigenina es un fluoróforo derivado de la acridina que muestra dos máximos de absorción a las longitudes de onda de 368 nm y 455 nm, y un espectro de emisión con un máximo centrado en 505 nm.

La fluorescencia de la lucigenina no se ve afectada por:

  • El pH
  • Iones (como nitrato, fosfato o sulfato)

Quenching (Apagamiento de la Fluorescencia)

El quenching se refiere a procesos que provocan una disminución del rendimiento cuántico de una sustancia dada y, por lo tanto, de su intensidad de fluorescencia. Proporciona evidencia de interacciones moleculares entre la molécula fluorescente y la molécula que origina el quenching, denominada quencher.

Puede dividirse en dos grupos:

  • Quenching colisional o dinámico: ocurre cuando la desactivación es resultado de los choques entre moléculas.
  • Quenching estático: ocurre cuando es el resultado de la formación de un complejo entre el fluoróforo y el quencher.

Preguntas Frecuentes sobre Fluorescencia

¿Cómo es el cociente de intensidad de fluorescencia en presencia de un quencher?

El cociente de intensidad de fluorescencia (I₀/I, donde I₀ es la intensidad sin quencher e I con quencher) será siempre positivo, ya que no se pueden emitir fotones negativos. Además, será mayor que 1, puesto que al aumentar la concentración del quencher, disminuye la intensidad de fluorescencia (I < I₀).

¿Cuál ocurre a mayor longitud de onda, la absorción o la fluorescencia?

Según el diagrama de Jablonski, que muestra los niveles energéticos de las moléculas, así como las transiciones radiativas y no radiativas, la fluorescencia ocurre a mayor longitud de onda. Esto se debe a que la fluorescencia implica una menor energía (mayor longitud de onda) en comparación con la absorción (mayor energía, menor longitud de onda). La transición energética siempre ocurre hacia un nivel de menor energía.