Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La PCR es una técnica in vitro de amplificación de ADN que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento concreto de ADN, partiendo de una cantidad mínima de ADN molde.

Aplicaciones de la PCR

Sus aplicaciones son innumerables en todos los campos de la biología, la medicina e incluso la paleontología:

  • Diagnóstico y pronóstico de ciertas enfermedades
  • Evolución y respuesta a tratamientos
  • Estudios de expresión génica
  • Mutagénesis
  • Estudios filogenéticos
  • Genotipado
  • Medicina forense

Proceso de la PCR

La PCR es un proceso enzimático, catalizado por una ADN polimerasa, basado en la replicación del ADN.

  • El diseño de “ciclos repetitivos de replicación de ADN in vitro” es la clave de la amplificación, puesto que las copias nuevas que se van obteniendo en cada ciclo sirven como molde para sintetizar otras nuevas en los ciclos siguientes. Esto provoca un aumento exponencial del número de copias.

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Tras un número determinado de repeticiones del ciclo básico de PCR se obtienen varios tipos de productos de amplificación, unos deseados y otros no deseados/inespecíficos, en distintas proporciones.

Productos de Amplificación de la PCR: Primer Ciclo

  • Fase de desnaturalización inicial: Se separan las dos cadenas del ADN nativo, las llamaremos N+ y N-.
  • Fase de hibridación: Cada cebador se une a una secuencia diana.
  • Fase de extensión: Se sintetizan dos cadenas nuevas de ADN, las cuales incluyen el fragmento deseado pero que tienen una longitud muy superior debido a que la ADN polimerasa sigue replicando la hebra molde hasta que se inicia el segundo ciclo y se produce la desnaturalización. Denominamos estas dos cadenas I+ e I-.

Resultado final del primer ciclo: N+/I- y N-/I+. Por tanto, se han formado 2 productos no deseados y 0 deseados.

PCR Estándar o Convencional

La PCR estándar, convencional o básica es la forma más simple de PCR en la que se amplifica un único fragmento de ADN, con un único par de cebadores y en un único proceso de amplificación a tiempo final.

Mezcla de Reacción de la PCR

La mezcla de reacción contiene todos los reactivos necesarios que deben estar presentes en el medio para que la PCR se desencadene de forma adecuada. Consiste en un tampón adecuado que contendrá disueltos todos los reactivos necesarios para replicar el ADN y aportará el pH y concentración salina adecuados para el buen funcionamiento de la ADN polimerasa (máxima fidelidad).

Los reactivos principales son:

  • Cloruro magnésico (iones Mg2+)
  • Desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs)
  • Cebadores
  • ADN polimerasa
  • ADN molde

El Termociclador

El termociclador es el aparato en el que se lleva a cabo la reacción PCR. Permite programar ciclos repetitivos con varias temperaturas y tiempos de incubación para que se desarrolle de forma automatizada.

Análisis de Resultados: Electroforesis en Gel

La presencia de una única banda del tamaño adecuado al fragmento que nos interesaba indica que la PCR ha funcionado correctamente. La observación de varias bandas de distintos tamaños indica la presencia de productos de amplificación no deseados.

Resultado Positivo

Cuando la PCR se realiza con fines exclusivos de detección, la observación de una banda específica es suficiente para afirmar que la secuencia diana está presente en la muestra estudiada.

Resultado Negativo

La ausencia de banda específica en una muestra problema indica, a priori, que la muestra no contiene la secuencia diana y, por tanto, que el resultado sería negativo.

Hibridación de Ácidos Nucleicos

Concepto y Aplicaciones de la Hibridación

La hibridación de ácidos nucleicos es el proceso mediante el cual dos cadenas monocatenarias de ADN o ARN se unen por complementariedad de bases nitrogenadas, formando una molécula bicatenaria. Se emplea en biología molecular para detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos mediante sondas marcadas, lo que permite su visualización posterior.

Las aplicaciones de la hibridación incluyen:

  • Detección de secuencias diana en muestras biológicas.
  • Identificación de mutaciones genéticas mediante sondas específicas.
  • Técnicas de diagnóstico molecular, como PCR, FISH y Southern blot.
  • Detección de ARN mensajero para análisis de expresión génica.

Bases Teóricas de la Hibridación

El proceso de hibridación se basa en los principios de desnaturalización y renaturalización de los ácidos nucleicos.

  • Desnaturalización: Separación de las dos cadenas de ADN mediante calor o cambios en el pH.
  • Renaturalización: Reasociación de las cadenas complementarias al disminuir la temperatura.

Estos procesos dependen de la secuencia de bases y la concentración de ADN en solución.

Características de las Sondas

Las sondas pueden ser monocatenarias o bicatenarias, largas (miles de nucleótidos) o cortas (oligonucleótidos). Se clasifican según su naturaleza en:

  • Sondas de ADN
    • De síntesis química: Son monocatenarias y de tamaño reducido (oligonucleótidos), con alta penetración en tejidos, pero baja especificidad y sensibilidad.
    • De ADN recombinante: Se obtienen por clonación y presentan alta sensibilidad y especificidad. Son bicatenarias y requieren desnaturalización previa.
    • De PCR: Se generan por amplificación y tienen tamaño intermedio.
  • Sondas de ARN (Ribosondas)
    • Son monocatenarias y generan híbridos ADN/ARN más estables. Sin embargo, son sensibles a la degradación por ARNasa.
  • Sondas Químicas Sintéticas
    • Sondas de Ácidos Nucleicos Peptídicos (APN o PNA): Hibridan más rápido y son más estables, pero tienen baja solubilidad.
    • Sondas de Ácidos Nucleicos Bloqueados (ANB o LNB): Mayor sensibilidad y especificidad, pero solo se obtienen por síntesis química.

Métodos de Marcaje de Sondas

  1. Desplazamiento de Mella (Nick Translation): Se utiliza para marcar sondas de ADN bicatenario de gran tamaño. La ADNasa I introduce mellas en la cadena, y la ADN polimerasa I rellena los huecos con nucleótidos marcados.
  2. Cebado Aleatorio (Random Priming): Se usa para marcar sondas de ADN bicatenario. Oligonucleótidos de 6 bases (hexámeros) se unen a la sonda desnaturalizada y actúan como cebadores para la ADN polimerasa, incorporando nucleótidos marcados.
  3. Marcaje Terminal: Se emplea la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), que incorpora nucleótidos marcados en el extremo 3’ de la sonda. Se puede marcar con un único nucleótido o con una cola de nucleótidos marcados.
  4. Marcaje por PCR: Se incorporan nucleótidos marcados durante la amplificación por PCR.
  5. Marcaje de Sondas de ARN: Se realiza durante la transcripción, usando una ARN polimerasa y ribonucleótidos marcados.

Purificación de las Sondas Marcadas

Para eliminar nucleótidos libres marcados y evitar interferencias en la detección, se utilizan:

  • Cromatografía de Exclusión por Tamaño: Se emplean geles de poliacrilamida en microcolumnas que retienen los nucleótidos libres y permiten recuperar la sonda marcada.
  • Cromatografía de Adsorción: Se usan matrices de lana de vidrio o sílice para retener impurezas y recoger la sonda purificada.

Técnicas de Hibridación Según el Medio

Las técnicas de hibridación se pueden clasificar según el medio en el que se realizan:

  • En Soporte Sólido: La muestra con la secuencia diana se inmoviliza en una membrana y luego se incuba con la sonda marcada. Ejemplos:
    • Dot blot
    • Southern blot
    • Northern blot
    • Microarrays (donde se fijan las sondas y se incuban con la muestra).
  • En Soporte Líquido: La hibridación ocurre en solución y se detecta mediante métodos indirectos (similar a ELISA). Ejemplos:
    • Técnica de captura de híbrido
    • Tecnología del ADN ramificado
  • Hibridación in situ (ISH): Se realiza directamente en células o tejidos para detectar secuencias específicas en su contexto fisiológico. Ejemplos:
    • FISH (hibridación fluorescente in situ)
    • CISH (hibridación cromogénica in situ)