Ventajas y Fundamentos de la PCR

1. Ventajas de la PCR frente a otras técnicas de Biología Molecular (BM)

Como técnica de amplificación, respecto a las técnicas de clonación en vectores mediante tecnología de ADN recombinante, la PCR ofrece:

  • Ahorro de tiempo.
  • Procesos completamente automatizados.

2. Necesidad del uso de cebadores en PCR

Los cebadores son claves para realizar una amplificación específica con éxito. La concentración final de cada cebador en la mezcla de reacción debe ser la misma y debe establecerse de forma experimental para cada pareja.

3. Tipos de ADN Polimerasas termoestables usadas en PCR

Se utilizan ADN Polimerasas termoestables, clasificadas según su actividad exonucleasa:

  • Actividad exonucleasa 5’→3′, pero sin actividad exonucleasa 3’→5′ (sin corrección de pruebas).
  • Actividad exonucleasa 5’→3′ y actividad exonucleasa 3’→5′ (con corrección de pruebas o proofreading).
  • Actividad transcriptasa inversa (usada en RT-PCR).

4. Parámetro que condiciona la temperatura de hibridación

La temperatura de hibridación (annealing) se realiza habitualmente entre 50°C y 65°C. El valor concreto depende de la temperatura de fusión (Tm) de los cebadores y suele estar comprendido en el rango Tm ± 5°C.

5. Reactivos de una mezcla Master Mix de PCR

Una mezcla Master Mix de PCR contiene:

  • Tampón (Buffer)
  • Agua estéril (grado MQ)
  • Taq ADN Polimerasa
  • Cebadores (Primers)
  • MgCl₂ (Cloruro de Magnesio)
  • dNTPs (desoxinucleótidos trifosfato)

6. Criterios de calidad del ADN molde

  • Alto grado de integridad.
  • Cociente A260/A280 entre 1,7 y 2,0, lo que garantiza que no está contaminado con proteínas.
  • Libre de contaminantes que puedan inhibir la reacción de PCR.

7. La fase de desnaturalización inicial

Es la etapa que inicia la reacción de PCR. Consiste en calentar la mezcla de reacción a 94-95°C durante varios minutos para asegurar la completa desnaturalización de todas las moléculas bicatenarias de ADN presentes en la mezcla de reacción.

8. Control Negativo (Blanco) en PCR

Para validar un resultado, en cada tanda de PCR se procesa un control negativo o blanco, en el que el ADN molde se sustituye por agua de grado PCR.

9. Variaciones para una PCR de Alta Fidelidad

Para realizar una PCR de alta fidelidad, se deben considerar las siguientes variaciones en la mezcla Master Mix:

  • Utilización de ADN polimerasas termoestables con actividad correctora (3’→5′ exonucleasa).
  • Favorecer las condiciones óptimas de mayor fidelidad de la enzima, ajustando el pH de la mezcla de reacción y la concentración de Mg²⁺.

10. Requisitos de los cebadores en una PCR Múltiple (Multiplex)

  • La temperatura óptima de hibridación (Tm) de todos los cebadores debe ser similar.
  • Los amplicones generados por cada pareja de cebadores deben ser distinguibles por electroforesis (diferente tamaño).
  • Deben diseñarse de manera que no puedan hibridar unos con otros, evitando la formación de dímeros o oligómeros.

PCR Cuantitativa (qPCR) y Termocicladores a Tiempo Real

11. Características de un Termociclador a Tiempo Real

  • Mayor rapidez en la detección cualitativa de la secuencia diana en una muestra.
  • Minimiza los problemas de contaminación.
  • Dado que la intensidad de fluorescencia es proporcional al ADN sintetizado, la PCR a tiempo real permite la cuantificación tanto de los amplicones como del ADN diana inicial.

12. Medición de fluorescencia con Balizas Moleculares

Cuando se utiliza un sistema de detección específico de secuencia por balizas moleculares, la fluorescencia se mide en la fase de hibridación (annealing).

13. Concepto de Cp (Cycle threshold) en qPCR

El Cp (Cycle threshold) es el punto de corte o el ciclo en el que la fluorescencia supera el umbral de detección en una PCR cuantitativa a tiempo real.

14. Concepto de Curva de Fusión en qPCR

Es la gráfica que representa la fluorescencia frente a la temperatura, utilizada para verificar la especificidad del producto amplificado.

Clonación Molecular de ADN

15. Concepto de Clonación Molecular de ADN

Es un proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN (genómico o ADNc) basada en la tecnología de ADN recombinante.

16. El Polylinker de un Vector de Clonación

Es un segmento corto donde se concentran todas las dianas de restricción. Se denomina Sitio Múltiple de Restricción (SMR) o Sitio de Múltiple Clonación (SMC).

17. Composición de un Fagémido

Está compuesto por un plásmido de origen bacteriano al que se le inserta una secuencia de origen del fago M13.

18. Levadura hospedadora más usada

La levadura más usada como célula hospedadora en las técnicas de clonación molecular es Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae).

19. Preparación de una secuencia de ADN para clonación

Se amplifica el ADN mediante PCR. Se recomienda el uso de polimerasas sin actividad correctora (como la Taq) porque generan un nucleótido de Adenina (A) extra en cada extremo 3′ del amplicón, facilitando la clonación TA.

20. Resultado de la digestión enzimática de un vector circular

Tras la digestión enzimática de un vector circular de ADN con dos dianas de restricción, se obtienen dos moléculas lineales con extremos cohesivos:

  1. Una molécula grande con el marcador genético, que será la base para el vector recombinante.
  2. Una molécula pequeña que no porta información genética de interés para la clonación y que será sustituida por el ADN extraño.

21. Definición de Electroporación

Consiste en aplicar cortos pulsos eléctricos de alto voltaje a una mezcla de células hospedadoras en suspensión y vectores recombinantes en solución, para inducir la captación del ADN.

22. Definición de Transformación y Tasa de Transformación

La Transformación consiste en la captación e internalización por parte de una bacteria de moléculas de ADN desnudas presentes en el medio externo, convirtiéndola en una célula hospedadora competente.

23. Selección de Clones Recombinantes mediante Estrategia de Genes Letales

La selección se realiza cultivando las bacterias en un medio con el antibiótico en cuestión:

  • Las bacterias que no son transformadas no crecen porque son sensibles al antibiótico.
  • Las bacterias transformadas con el vector recombinante se desarrollan.
  • Las bacterias transformadas con el vector no recombinante mueren por efecto de la proteína letal (cuya expresión es interrumpida por la inserción del ADN de interés en el vector recombinante).

24. Tipos de Bibliotecas de ADN

  • Bibliotecas Genómicas.
  • Bibliotecas Cromosómicas.
  • Bibliotecas de ADNc.

25. Aplicaciones Industriales de la Clonación Molecular

  • Interés médico y farmacéutico (producción de proteínas terapéuticas).
  • Industria química.
  • Industria de la alimentación.
  • Ámbito medioambiental.