Tipos de Muestras Citológicas según su Procedencia

  • Muestras procedentes de líquidos fisiológicos: sangre, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido prostático, contenido gástrico.
  • Muestras procedentes de líquidos y fluidos patológicos: líquido de derrames (pleural, peritoneal), contenido de un quiste, expectoración bronquial, líquido procedente del lavado de esófago, estómago, colon.
  • Muestras procedentes de citopunciones: punción de médula ósea, punción hepática.
  • Muestras procedentes de frotis y legrados: frotis vaginal, cepillado bronquial.
  • Piezas operatorias.

Toma de Muestras Citológicas: Técnicas y Procedimientos

El estudio citológico se puede realizar sobre diversos tipos de muestras, incluyendo lesiones cutáneas o subcutáneas, ganglios linfáticos, órganos, piel, médula ósea y líquidos orgánicos. Para su obtención, existen cuatro tipos principales de técnicas:

  1. Impronta
  2. Raspado
  3. Frotis
  4. Punción-Aspiración con Aguja Fina (PAAF)

Impronta

Esta técnica consiste en apoyar un portaobjetos sobre el tejido lesionado para que las células desprendidas se adhieran al porta. Se puede realizar con fragmentos de tejido obtenidos por biopsia o en lesiones externas en animales vivos.

Cuando se utilizan fragmentos de tejido, es conveniente apoyar varias veces, sin presionar, la cara de la muestra sobre un papel secante para eliminar la contaminación de sangre. Posteriormente, se apoyará la muestra varias veces sobre portas limpios hasta obtener una capa uniforme y fina de células.

Si se utiliza esta técnica en lesiones externas del animal vivo, es importante realizar una impronta, apoyando ligeramente el porta sobre la zona afectada, antes de lavar la lesión. Después, se lavará la lesión con una gasa y suero fisiológico, se reavivará la lesión mediante raspado con una cuchilla de bisturí, se secará con material absorbente y se volverá a realizar otra impronta.

Raspado

Esta técnica consiste en el raspado de la superficie de una lesión con una cuchilla de bisturí. Su mayor utilidad es el estudio de lesiones externas.

Primero, se lavará la lesión con suero fisiológico y se secará la zona con papel absorbente. Se echará una gota de aceite sobre la zona elegida y sobre la hoja de bisturí para que se adhiera el material a raspar. Posteriormente, se apoyará el filo de la cuchilla perpendicular a la superficie de la lesión y se desplazará varias veces sobre la misma, sin ejercer excesiva presión.

El material obtenido se transfiere al centro de un portaobjetos limpio y se extiende siguiendo cualquiera de las técnicas que se comentarán posteriormente en la preparación de extensiones.

Frotis

Esta técnica consiste en la obtención de células deslizando suavemente un hisopo o bastoncillo de algodón sobre una superficie orgánica. Conviene humedecer el bastoncillo con suero fisiológico para prevenir el daño en las células de la muestra.

Se usa, fundamentalmente, cuando no es posible obtener muestras mediante impronta, raspado o aspiración con aguja fina, por ejemplo, en trayectos fistulosos o para citología vaginal.

Para realizar un raspado, se echará una gota de aceite sobre la zona y sobre la hoja de bisturí para mejorar la adherencia de la muestra. Una vez obtenida la muestra, se deberá apoyar y hacer rotar el hisopo sobre el porta, sin ejercer mucha presión y sin pasar dos veces por el mismo sitio. Para realizar un raspado, se echará una gota de aceite sobre la zona y sobre la hoja de bisturí para mejorar la adherencia de la muestra.

Técnicas de Concentración Celular

Centrifugación

Es una técnica útil para muestras seromucosas y grandes volúmenes de líquidos serosos (líquido quístico y procedentes de lavados). El método consiste en:

  • Anotar el aspecto mucoso de la muestra.
  • Agitar la muestra para resuspender las células que contiene y verter igual cantidad en dos tubos de centrífuga.
  • Centrifugar a una velocidad aproximada de 2000 rpm durante 5 minutos. Una vez centrifugado, decantar el sobrenadante, mezclar el sedimento con unas gotas de sobrenadante para resuspender las células y depositar con una pipeta Pasteur una gota de este sedimento sobre un portaobjetos previamente identificado.
  • Realizar una extensión directa con esta parte de la muestra o citocentrifugarla.
  • Fijar rápidamente con la solución fijadora.

Citocentrifugación

Esta técnica se realiza con una centrífuga especializada llamada citospín. Pequeñas alícuotas (cantidades iguales) de muestra líquida se hacen girar lateralmente sobre un portaobjetos para formar una monocapa de células. Es una técnica de gran utilidad y rapidez para la preparación de muestras líquidas.

Filtros de Membrana

Constituyen una técnica de concentración de células en muestras líquidas de baja densidad celular (como la orina), ya que rescatan un mayor número de células que la citocentrifugación. Estos filtros son membranas porosas de plástico cuyos poros varían de 8 a 10 micras. Los más utilizados son:

  • Tipo Millipore (de acetato de celulosa).
  • Filtros Nucleopore (de policarbonato).

Se realiza una filtración con la muestra y posteriormente se examina el filtro. En citología se usan sobre todo los filtros SM, cuyos poros van de 1-2 a 5 micras. Cada cm² de superficie contiene millones de poros capilares que ocupan más del 80% del volumen total. Este filtrado no necesita ningún fraccionamiento del líquido y no hay que extraer el sedimento y colocarlo sobre el portaobjetos; ello permite una estimación cuantitativa de las células cancerosas en un volumen de líquido dado. Sin embargo, puede haber superposiciones celulares molestas y la membrana filtrante puede experimentar una desecación rápida.

El líquido se filtra a la presión atmosférica o a una presión negativa de 25 mm de mercurio; una presión negativa más fuerte no es aconsejable, ya que podría deformar las células. La fijación debe hacerse únicamente con alcohol etílico al 95%, pues el alcohol absoluto, el éter o la acetona podrían provocar la disolución del filtro.

El filtro con la muestra, sujeto con una pinza, se coloca sobre un portaobjetos y se tiñe.

Fijación de Muestras Citológicas

Su principal objetivo es conservar el detalle morfológico de las células en un estado lo más parecido posible a la célula en el tejido vivo. Esto se consigue con fijadores que deshidratan las células, inactivan las enzimas autolíticas, coagulan las proteínas y penetran en la membrana celular. Es un paso indispensable si no se quiere una extensión deteriorada u oxidada que no tome bien los colorantes y que no permita una correcta lectura al microscopio.

La fijación debe realizarse de inmediato a la toma y extensión del material citológico, cuando la preparación esté aún húmeda. No existe el fijador perfecto; todos causan contracción celular y cada uno actúa con una velocidad diferente.

Procesos Previos a la Fijación: Extensión

En el caso de las muestras obtenidas por raspado o por PAAF, el material obtenido debe ser extendido sobre el portaobjetos para formar una capa fina de células que permita una correcta visualización. Es muy importante realizar el manejo de la muestra con mucho cuidado, evitando ejercer excesiva presión para no dañar las células. Para evitar que la muestra se seque, se deberá realizar la extensión lo más rápidamente posible una vez que se coloque la gota de muestra en el portaobjetos.

Todas las extensiones deben ser marcadas con rotuladores indelebles resistentes al alcohol o con lápiz (en portas esmerilados) para su correcta identificación.

Existen varias formas de realizar la extensión; aquí se desarrollan dos de ellas: la técnica de “aplastamiento” (squash) y la de extensión sanguínea.

Técnica de “Aplastamiento” (Squash)

Esta técnica de extensión consiste en los siguientes pasos:

  • Poner el material en forma de gota en uno de los extremos del portaobjetos.
  • Apoyar, sin ejercer mucha presión, un segundo portaobjetos por una de sus caras y en sentido perpendicular al primero.
  • Con un movimiento rápido, deslizar el segundo portaobjetos sobre el primero.

Técnica de Extensión Sanguínea

Esta técnica de extensión puede usarse cuando la muestra obtenida es muy fluida. Se utiliza sobre todo para extender las gotas de sangre para hacer un frotis. Se utilizarán dos portas: uno con la gota de muestra en un extremo, y el otro para realizar la extensión. El porta de arriba puede ser sustituido por un cubreobjetos.

  • Apoyar uno de los bordes cortos del porta de extensión (o un cubreobjetos) sobre el porta con la muestra, formando un ángulo de 30-40º.
  • Deslizar el porta de extensión hasta contactar con la gota, con lo que el material se extenderá en forma de línea en el borde corto del porta de extensión.
  • Con un movimiento rápido y suave, deslizar el porta de extensión, alejándose de la gota, formándose una capa uniforme.

Fijación y Tinción en Citología

Para que las células se adhieran al portaobjetos y para evitar que se degeneren, es necesario fijar la muestra. El método de fijación puede variar según la técnica de tinción que se vaya a utilizar. Normalmente, en la clínica o para el envío de muestras a otro laboratorio, la muestra debe secarse al aire y luego fijarse con metanol. También puede utilizarse el primer reactivo de las técnicas rápidas.

Muchas veces la tinción de las extensiones citológicas se hace en la propia clínica para su interpretación, pero otras veces se remite. Si la muestra se remite a un laboratorio especializado, es mejor no teñirlas en la clínica; hay que fijarlas y dejarlas sin teñir.

Cuando la preparación se tiñe en la clínica, se usa normalmente la Técnica rápida Diff-Quik. Esta técnica de tinción es muy utilizada debido a su sencillez y rapidez; todos sus reactivos son comerciales y están ajustados para realizar la técnica en el menor tiempo posible.

Citospray

Es un fijador en forma de aerosol, un producto comercial que contiene una mezcla de alcohol isopropílico y una materia plástica, el polietilenglicol, protectora de la desecación. Con este spray se pulveriza toda la superficie del portaobjetos de forma rápida y sencilla; se debe aplicar a 25-30 cm de distancia de la muestra. Se aplica al material citológico inmediatamente después de su extensión en el portaobjetos.

Es muy usado por su simplicidad y buenos resultados, y se recomienda sobre todo cuando las extensiones deben ser enviadas a otros laboratorios para su tinción (extensiones ginecológicas, cepillados orofaríngeos, esofágicos, bronquiales, etc.). Por el contrario, debe evitarse su uso en extendidos de materiales líquidos realizados en el propio laboratorio y en los hematológicos para no provocar agrupamiento de los hematíes.

Antes de teñir, debe extraerse el citospray mediante pases sucesivos de 5-10 minutos cada uno por etanol al 96%. Alternativamente, y dado que el líquido del aerosol es soluble en agua, la extensión puede ser teñida inmediatamente después de rociarla, con lo que se acorta el tiempo total del proceso.

El secado al aire sin fijar se emplea cuando se van a realizar ciertas tinciones, como por ejemplo la de May-Grünwald Giemsa. Con esta tinción no se ve bien la cromatina nuclear y se usa en citologías hematológicas.