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Cromatografía Líquida de Alta Resolución: Detectores, Fases Móviles y Eficiencia de Columna
Detectores Comunes en HPLC
La elección del detector es fundamental en la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), ya que determina la sensibilidad y selectividad del método. A continuación, se describen los detectores más utilizados:
Detector de Absorción UV-Vis
- Es el más común en HPLC.
- Puede ser de longitud de onda fija, variable o de arreglo de diodos.
- Mide la absorción de luz por parte de los analitos.
- Es poco selectivo.
- Útil para sustancias con grupos cromóforos.
Detector de Fluorescencia
- Ofrece alta sensibilidad y selectividad.
- Solo es útil para sustancias que emiten fluorescencia.
- Muchas sustancias no fluorescen de forma natural, por lo que se requiere derivatización previa con agentes que generen compuestos fluorescentes.
Detector de Índice de Refracción (IR)
- Es un detector universal, ya que detecta cualquier cambio en el índice de refracción del eluyente.
- Presenta poca sensibilidad y selectividad.
- No es adecuado para mezclas complejas ni para compuestos en baja concentración.
Detector Electroquímico
- Es muy sensible, pero solo útil para compuestos electroactivos.
- Ideal para analizar moléculas redox activas (como neurotransmisores, fenoles, etc.).
- Su respuesta depende del potencial aplicado y de las condiciones del medio.
Detector de Masas (MS)
- Ofrece alta sensibilidad y alta selectividad.
- Permite la identificación directa del analito mediante su espectro de masas.
- Muy útil para el análisis de mezclas complejas o compuestos desconocidos.
- Requiere acoplamiento con sistemas de ionización (como ESI o APCI).
Separación de Compuestos por RP-HPLC: Caso Práctico
Dado los compuestos A y B con valores de pKa = 74 y pKb = 8 respectivamente. Explica qué fase móvil emplearías para separarlos por RP-HPLC y qué debes hacer para reducir el tiempo de análisis en caso de que sea excesivamente largo.
Tipo de Fase Móvil
- En cromatografía de fase inversa (RP-HPLC), se emplea una fase móvil polar, compuesta por agua y un disolvente orgánico:
- Metanol (más económico) o acetonitrilo (mayor eficacia y menor viscosidad).
Control del pH
- Es crucial ajustar el pH con un buffer regulador. El pH debe alejarse de los valores de pKa y pKb para evitar formas intermedias de ionización.
- Un pH alrededor de 5 es adecuado:
- Mantiene protonada la base (B) (forma catiónica).
- Mantiene el ácido (A) en su forma no ionizada o ligeramente ionizada.
- Esto mejora la diferenciación de polaridad y favorece la separación.
Reducción del Tiempo de Análisis
- Utilizar un gradiente de fase móvil (aumentando progresivamente el porcentaje del disolvente orgánico).
Precauciones al Analizar Vitaminas en Leche por HPLC
Si tengo que analizar las vitaminas en una muestra de leche por HPLC, ¿qué precauciones tengo que tener?
Al analizar vitaminas en una muestra de leche por HPLC, es fundamental tomar las siguientes precauciones para asegurar la integridad de la columna y la precisión de los resultados:
Evitar la Obstrucción de la Columna
- Las proteínas de la leche pueden adsorberse de forma irreversible en la fase estacionaria, lo que daña la columna. Por ello, es esencial eliminar las proteínas previamente.
Eliminación de Proteínas (Tratamiento Previo de la Muestra)
- Precipitación: Se añaden ácidos (como acético o fórmico) junto con etanol o acetonitrilo para precipitar las proteínas.
- Ultrafiltración: Centrifugación para separar las proteínas retenidas en el filtro.
Bloqueo de Grupos Silanoles
- A pH básico, los grupos Si-OH (que se convierten en SiO⁻) de la columna pueden atraer proteínas cargadas positivamente. Para evitarlo, se bloquean añadiendo un agente bloqueante a la fase móvil (por ejemplo, trietilamina).
Otras Precauciones
- Controlar la temperatura del sistema, ya que las vitaminas son sensibles al calor y pueden descomponerse.
Uso y Tipos de Gradiente en HPLC
¿Cuándo es necesario realizar un gradiente en HPLC?
Un gradiente en HPLC implica modificar progresivamente la composición de la fase móvil, generalmente aumentando el porcentaje del disolvente orgánico (como metanol o acetonitrilo) y disminuyendo el de agua. Este proceso incrementa la fuerza de elución, permitiendo que los analitos salgan más rápidamente del sistema. En cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), se emplea un gradiente de elución cuando:
- Existen compuestos de distinta polaridad que eluyen en tiempos muy separados, lo que prolongaría excesivamente el tiempo de análisis.
- Hay solapamiento de picos (compuestos eluyen en tiempos muy cercanos).
- Se busca mejorar la resolución de los picos.
Tipos de Gradiente en HPLC
- Lineal: La composición cambia de forma uniforme con el tiempo. Es el tipo más común.
- Cóncavo: El cambio es más lento al inicio, lo que es útil para separar compuestos que eluyen pronto y presentan solapamiento.
- Convexo: El cambio es rápido al inicio, útil para la elución eficiente de compuestos más retenidos hacia el final del análisis.
Gradiente para Compuestos de Elución Rápida y Solapamiento
Si se tienen compuestos que eluyen rápido y presentan solapamiento de picos, se recomienda emplear un gradiente cóncavo.
Inyección Split y Splitless en Cromatografía
Inyección Split
- Cómo funciona: Solo una parte de la muestra entra en la columna; el resto se elimina por una salida secundaria (split vent).
- Ventaja: Ideal para muestras concentradas, ya que evita sobrecargar la columna.
- Inconveniente: Menor sensibilidad, dado que solo una fracción de la muestra se analiza. No es adecuada para el análisis de trazas.
- Otro problema: Puede causar discriminación de compuestos según su volatilidad.
Inyección Splitless
- Cómo funciona: Toda la muestra entra en la columna, sin división.
- Ventaja: Ofrece una sensibilidad mucho mayor, ideal para el análisis de trazas.
- Mejor eficiencia: La muestra se preconcentra en la cabeza de la columna, lo que reduce las pérdidas de eficacia.
- Inconveniente: No es apta para muestras muy concentradas, ya que puede saturar la columna.
La Ecuación de Van Deemter: Eficiencia de Columna
La ecuación de Van Deemter describe cómo afecta la velocidad de flujo de la fase móvil a la eficiencia de la columna.
H: Altura equivalente a un plato teórico (HETP), que mide la eficiencia de la columna.
u: Velocidad lineal de la fase móvil.
Significado de los Términos de Van Deemter
Término A – Difusión Eddy (A)
- Causado por los caminos irregulares que sigue el analito entre las partículas del relleno.
- Es independiente de la velocidad de la fase móvil.
- Depende del tamaño de las partículas: cuanto más pequeñas sean, menor será el valor de A.
Término B – Difusión Longitudinal (B/u)
- Ocurre cuando el analito se difunde a lo largo de la columna.
- Disminuye a velocidades de flujo más altas.
- Afectado por:
- Tipo de columna.
- Mayor temperatura y menor viscosidad de la fase móvil resultan en mayor difusión.
Término C – Resistencia a la Transferencia de Masa (C·u)
- Relacionado con la dificultad del analito para equilibrarse entre la fase móvil y la fase estacionaria.
- Aumenta al aumentar la velocidad de la fase móvil.
- Depende de:
- Espesor de la fase estacionaria: una fase más fina es mejor.
- Coeficiente de difusión (Ds): un mayor Ds implica mejor eficiencia.
- Es mejor usar fases estacionarias líquidas, poco viscosas y operar a alta temperatura.
El término C·u de la ecuación de Van Deemter se descompone en dos contribuciones principales:
C = Cm + Cs
Cm, que representa la resistencia a la transferencia de masa en la fase móvil (debido al flujo desigual cerca de la fase estacionaria), y Cs, que es la resistencia en la fase estacionaria (por el intercambio lento de los analitos). Ambos términos aumentan al incrementar la velocidad del flujo, lo que resulta en el ensanchamiento de los picos y una disminución de la eficiencia.
Interpretación de la Ecuación de Van Deemter
- Existe una velocidad óptima de la fase móvil donde la altura de plato (H) es mínima, lo que indica la máxima eficiencia de la columna.
- A velocidades muy bajas, domina la difusión longitudinal (término B/u).
- A velocidades altas, domina la resistencia a la transferencia de masa (término C·u).